Préparation de grands échantillons biologiques pour une haute

Nature Protocols volume 18, pages 1441-1461 (2023)Citer cet article

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L’imagerie à différentes échelles est essentielle pour comprendre la morphologie des organes sains et les changements physiopathologiques. La morphologie tridimensionnelle à l'échelle macro et micrométrique de grands échantillons, y compris des organes humains intacts, est possible grâce à la microtomographie à rayons X (en utilisant des sources de laboratoire ou synchrotron). La préparation de grands échantillons pour l’imagerie haute résolution est toutefois difficile en raison de limitations telles que le rétrécissement de l’échantillon, un contraste insuffisant, le mouvement de l’échantillon et la formation de bulles lors du montage ou de la numérisation. Ici, nous décrivons la préparation, la stabilisation, la déshydratation et le montage de grands échantillons de tissus mous pour la microtomographie à rayons X. Nous détaillons le protocole appliqué aux organes humains entiers et à la tomographie hiérarchique à contraste de phase au Centre européen de rayonnement synchrotron, mais il est applicable à une gamme d'échantillons biologiques, y compris des organismes complets. Le protocole améliore le contraste lors de l'utilisation de l'imagerie par rayons X, tout en empêchant le mouvement de l'échantillon pendant l'analyse, même avec des orientations différentes de l'échantillon. Les bulles piégées lors du montage et celles formées lors du balayage (dans le cas de l'imagerie par rayons X synchrotron) sont atténuées par plusieurs étapes de dégazage. La préparation des échantillons est également compatible avec l’imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie et l’observation histologique. La préparation et le montage des échantillons nécessitent 24 à 36 jours pour un gros organe tel qu'un cerveau ou un cœur humain entier. Le temps de préparation varie en fonction de la composition, de la taille et de la fragilité du tissu. L’utilisation du protocole permet la numérisation d’organes intacts d’un diamètre de 150 mm avec une taille de voxel local de 1 μm. Le protocole nécessite des utilisateurs possédant une expertise dans la manipulation d’organes humains ou animaux, dans les opérations de laboratoire et dans l’imagerie aux rayons X.

La quantification de la morphologie des organes humains, tant en matière de santé que de maladie, est une tâche complexe qui peut être abordée par des modalités d'imagerie spatiale multimodales, capables de s'étendre à plusieurs échelles dimensionnelles. La caractérisation morphologique complète des tissus nécessite la détection des interactions entre et entre les échelles ; cependant, la plupart des techniques d'imagerie sont limitées soit par la résolution, soit par le champ de vision, ce qui rend difficile la liaison des observations et des données macroscopiques avec les données microscopiques. Les approches conventionnelles d'histologie1,2,3 ou de microscopie électronique4,5,6 permettent de visualiser l'organisation microstructurale et la composition du tissu à travers des coupes en série, et les données peuvent être convenablement quantifiées ; cependant, ces approches nécessitent normalement un échantillonnage et une section du tissu et sont extrêmement laborieuses et chronophages. La compensation optique combinée à la microscopie à feuille de lumière peut fournir un large champ de vision avec une haute résolution ; cependant, l’élimination des tissus nécessite également de longs délais et est souvent coûteuse ; de plus, la profondeur d’imagerie d’un microscope à feuille lumineuse est limitée par la distance de travail de l’objectif7,8. Même lorsque des organes humains adultes entiers8 ou des animaux entiers9 ont été nettoyés sur une période de plusieurs mois, leur imagerie reste un défi. Des inconvénients similaires s'appliquent à la tomographie par cohérence optique10,11, à la microscopie multiphotonique12 ou à la microscopie confocale13,14, qui peuvent capturer la microstructure tridimensionnelle (3D) locale du tissu à l'échelle cellulaire, mais ont une pénétration tissulaire limitée, ce qui entrave l'imagerie des tissus profonds15. Récemment, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) à haute résolution a permis d’obtenir une taille de voxel isotrope de 100 µm dans l’ensemble d’un cerveau humain ex vivo16. Bien que l’IRM soit non destructive et dispose d’un large champ de vision17, la résolution n’est toujours pas suffisante pour examiner la microstructure tissulaire. Les techniques d'imagerie hiérarchique sont capables de surmonter le compromis entre résolution et champ de vision. Dans une approche hiérarchique, plusieurs images du même échantillon sont acquises à différentes résolutions pour combler les différentes échelles. La tomodensitométrie (µCT) a été utilisée pour imager des poumons entiers avec une résolution de voxels de 150 µm, suivie d'une extraction ultérieure de carottes de biopsie dans les poumons ; ces petits noyaux ont ensuite été numérisés avec µCT pour obtenir des voxels de 10 µm18.